问题状态

HPLC原理就是利用固定相与流动相的极性的差异,而达到分散物质目的。

(一)有效液相色谱阐发的流程

由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统,然后输出,经流量与压力测量之后,导入进样器。被测物由进样器注入,并随流动相通过色谱柱,在柱上进行分散后进入检测器,检测信号由数据处理设备收罗与处理,并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分散(极性范围比较宽)还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似,不同的是气相色谱转变温度,

而HPLC转变的是流动相极性,使样品各组分在***佳条件下患上以分散。

有效液相色谱法按分散机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法(正相与反相)、离子交换色谱法、离子对色谱法及份子排阻色谱法。

1.液固色谱法 使用固体吸附剂,被分散组分在色谱柱上分散原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分散。分散过程是一个吸附-解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝,粒度5~10μm。适用于分散份子量200~1000的组分,大多数用于非离子型化合物,离子型化合物易产生拖尾。常用于分散同分异构体。

2.液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面,或化学键合于担体表面而形成的固定相,分散原理是根据被分散的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分散。分散过程是一个分配平衡过程。

涂布式固定响应具有杰出的惰性;流动相须***预先用固定相饱和,以减少固定相从担体表面流失;温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化;另外在流动相中存在的固定相也使样品的分散和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失,现在已很少接纳。现在多接纳的是化学键合固定相,如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。

液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。

正相色谱法 接纳极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相);流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷),常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分散中常极性和极性较强的化合物(如酚类、***类、羰基类及氨基酸类等)。

反相色谱法 一般用非极性固定相(如C18、C8);流动相为水或缓冲液,常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分散非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用***为广泛,据统计,它占全般HPLC应用的80%摆布。

跟着柱填料的快速成长,反相色谱法的应用范围逐渐扩大,现已应用于某些无机样品或易解离样品的阐发。为控制样品在阐发过程的解离,常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是,C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5(2~8),太高的pH值会使硅胶溶解,太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。

正相色谱法与反相色谱法比较表

正相色谱法

反相色谱法

固定相极性

高～中

中～低

流动相极性

低～中

中～高

组分洗脱次序

极性小先洗出

极性大先洗出

从上表可看出,当极性为中常时正相色谱法与反相色谱法没有较着的界线(如氨基键合固定相)。

3.离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂,常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架,在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基(称阳离子交换树脂)或季氨基(阴离子交换树脂)。被分散组分在色谱柱上分散原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换,根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷魔力而分散。

缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分散组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分散子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外,它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可转变化合物的解离程度,继续往前影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大,则离子强度高,不利于样品的解离,导致样品较快流出。离子交换色谱法主要用于阐发有机酸、氨基酸、多肽及核酸。

4.离子对色谱法 又称偶离子色谱法,是液液色谱法的分支。它是根据被测组分散子与离子对试药离子形成中性的离子对化合物后,在非极性固定相中溶解度增大,从而使其分散效果改善。主要用于阐发离子强度大的酸碱物质。

阐发碱性物质常用的离子对试药为烷基磺酸盐,如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。

阐发酸性物质常用四丁基季铵盐,如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。

离子对色谱法常用ODS柱(即C18),流动相为甲醇-水或乙腈-水,水中加入3~10 mmol/L的离子对试药,在一定的pH值范围内进行分散。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。

5.排阻色谱法 固定相是有一定孔径的多孔性填料,流动相是可以溶解样品的溶剂。小份子量的化合物可以进入孔中,滞留时间长;大份子量的化合物不能进入孔中,直接随流动相流出。它利用份子筛对份子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分散。常用于分散高份子化合物,如社团提取物、多肽、蛋白质、核酸等。

正相色谱法

反相色谱法

固定相极性

高～中

中～低

流动相极性

低～中

中～高

组分洗脱次序

极性小先洗出

极性大先洗出

有效液相色谱法是在经典色谱法的基础上,引用了气相色谱的理论,在技能上,流动相改为高压运送(***高运送压力可达4.9′107Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成,从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高灵敏度的检测器,可对流出物进行连续检测。

特点

1.高压:液相色谱法以液体为流动相(称为载液),液体流经色谱柱,受到阻力较大,为了迅速地通过色谱柱,须***对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。

2. 高速:流动相在柱内的流速较经典色谱快患上多,一般可达1～10ml/min。有效液相色谱法所需的阐发时间较之经典液相色谱法少患上多,一般少于 1h 。

3. 有效:近来研究出很多新型固定相,使分散效率大大提高。

4.高灵敏度:有效液相色谱已广泛接纳高灵敏度的检测器,进一步提高了阐发的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外,用样量小,一般几个微升。

5.顺应范围宽:气相色谱法与有效液相色谱法的比较:气相色谱法虽具有分散能力好,灵敏度高,阐发速度快,操作方便等优点,但是受技能条件的限制,沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行阐发。而有效液相色谱法,只要求试样能制成溶液,而不需要气化,因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对份子量大(大于 400 以上)的有机物(这些物质几乎占有机物总额的 75% ～ 80% )原则上都可应用有效液相色谱法来进行分散、阐发。 据统计,在已知化合物中,能用气相色谱阐发的约占20%,而能用液相色谱阐发的约占70～80%。

有效液相色谱按其固定相的性质可分为有效凝胶色谱、疏水性有效液相色谱、反相有效液相色谱、有效离子交换液相色谱、有效亲和液相色谱以及有效会聚液相色谱等类型。用不同类型的有效液相色谱分散或阐发各类化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是有效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、反复性好,

有效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、.分散系统、检测系统和数据处理系统,下面将别离叙述其各自的组成与特点。

1.进样系统

一般接纳隔阂注射进样器或高压进样间完成进样操作,进样量是恒定的。这对提高阐发样品的反复性是有益的。

2.输液系统

该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l.47～4.4X107Pa,流速可调且稳定,当高压流动相通过层析柱时,可降低样品在柱中的扩散效应,可加速其在柱中的移动速度,这对提高分辨率、回收样品、连结样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存错和梯度仪,可使流动相随固定相和样品的性质而转变,包括转变洗脱液的极性、离子强度、PH值,或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各类物质(即使仅有一个基团的差别或是同分异构体)都能获患上有用分散。

3.分散系统

该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10～50cm(需要两根连用时,可在二者之间加一连接管),内径为2～5mm,由"优质不锈钢或厚壁试管或钛合金等材料制成,住内装有直径为5～10μm粒度的固定相(由基质和固定液构成).固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成,它们都有惰性(如硅胶表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔径可达1000?)和比表面积大的特点,加之其表面经过机械涂渍(与气相色谱中固定相的制备一样),或用化学法偶联各类基因(如磷酸基、季***基、羟甲基、苯基、氨基或各类长度碳链的烷基等)或配体的有机化合物。因此,这种固定相对结构不同的物质有杰出的选择性。例如,在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素(PSA)后,就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分散出来。

另外,固定相基质粒小,柱床极易达到均匀、致密状态,极易降低涡流扩散效应。基质粒度小,微孔浅,样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论阐发,基质粒度小,塔板理论数N就越大。这也进一步证实基质粒度小,会提高分辨率的道理。

再者,有效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C,通过改善传质速度,缩短阐发时间,就可增加层析柱的效率。

4.检测系统

有效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。

(1)紫外检测器

该检测器适用于对紫外光(或可见光)有吸收性能样品的检测。其特点:使用面广(如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用);灵敏度高(检测下限为10-10g/ml);线性范围宽;对温度和流速变化不敏感;可检测梯度溶液洗脱的样品。

(2)示差折光检测器

凡具有与流动相折光率不同的样品组分,均可使用示差折光检测器检测。目前,糖类化合物的检测大多使用此检测系统。这一系统通用性强、操作简单,但灵敏度低(检测下限为10-7g/ml),流动相的变化会引起折光率的变化,因此,它既不舒服用于痕量阐发,也不舒服用于梯度洗脱样品的检测。

(3)荧光检测器

凡具有荧光的物质,在一定条件下,其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此,这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物(如多环芳烃、氨基酸、***类、维生素和某些蛋白质等)的测定,其灵敏度很高(检测下限为10-12～10-14g/ml),痕量阐发和梯度洗脱作品的检测均可接纳。

(5)数据处理系统

该系统可对测试数据进行收罗、贮存、显示、打印和处理等操作,使样品的分散、制备或鉴定工作能正确开展。